普通PCR的擴(kuò)增參數(shù)一般涉及到溫控、恒溫時(shí)間、循環(huán)次數(shù)。

溫度我們可分為變性溫度、退火溫度，延伸溫度；而PCR反應(yīng)變性的溫度一般是在92~98℃之間進(jìn)行，合理的退火溫度從55℃~70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃，延伸溫度PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。

變性溫度與時(shí)間

變性溫度不夠，靶核酸解鏈的不完全是PCR失敗的主要原因。通常93~94攝氏度1分鐘就足夠可以使模板DNA變性；溫度不能過(guò)高且時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，這樣會(huì)損害Taq DNA聚合酶的活性。

退火溫度與時(shí)間

PCR實(shí)驗(yàn)，變性溫度快速的降至退火溫度，那么變性的DNA又可復(fù)性，重新形成雙鏈。而模板DNA比引物長(zhǎng)且復(fù)雜，所以模板DNA與引物之間的結(jié)合比模板DNA與模板DNA結(jié)合會(huì)更容易。退火的溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基的組成、濃度和靶核酸的長(zhǎng)度等。為了減少引物與模板之間的非特異性復(fù)性，可以適當(dāng)?shù)倪x擇較高的復(fù)性溫度。復(fù)性時(shí)間一般在30~60s，可以使引物與模板之間可以充分的復(fù)性。

延伸溫度與時(shí)間

延伸溫度一般選在70~75℃之間，溫度過(guò)高、過(guò)低都不易使引物與模板之間的結(jié)合；延伸時(shí)間一般根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短來(lái)定的。

循環(huán)次數(shù)

PCR的循環(huán)次數(shù)是由模板模板DNA的濃度所決定的。一般在30~40次，次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物也就越多。